一、適用范圍與原理
檢測對象：豬瘟病毒（CSFV，RNA病毒）
方法類型：一步法熒光RT-PCR（TaqMan探針，F(xiàn)AM通道）
原理：反轉錄+PCR同步進行，探針與靶序列結合后發(fā)光，實時監(jiān)測熒光，以Ct值判定陰陽性。
二、儀器與試劑（提前準備）
儀器
實時熒光定量PCR儀（支持FAM通道）
高速冷凍離心機（4℃，12000g）
渦旋振蕩器、金屬浴/水浴、冰盒
無RNase離心管（1.5mL、0.2mLPCR管）、濾芯吸頭
試劑（無RNase）
無菌PBS（pH7.2–7.4）
RNA提取試劑盒（磁珠法/離心柱法，或TRIzol）
豬瘟熒光RT-PCR試劑盒（含：RT-PCR反應液、酶混合液、CSFV引物探針、陽性對照、陰性對照）
DEPC水、75%乙醇（RNase-free）
三、樣品采集與處理（關鍵防降解）
1.樣品類型
選擇：脾臟、扁桃體、淋巴結；其次：全血（抗凝）、血清、組織勻漿。
2.組織樣品處理（10%勻漿）
取0.1g組織，加0.9mL無菌PBS（1:9，W/V）
充分研磨（勻漿機/研缽）
4℃、12000g離心15min
取上清轉移至新1.5mL管，-80℃保存（避免反復凍融）
3.全血/血清
全血：EDTA抗凝，4℃≤24h，長期-80℃
血清：分離后同法保存
四、病毒RNA提取（磁珠法為例，常用）
取200μL樣品上清至裂解液管，渦旋1min，室溫靜置5min
加20μL磁珠，混勻，室溫吸附10min（每2min輕搖）
磁力架吸附2min，棄上清
加500μL洗滌液1，重懸磁珠，吸附棄上清
加500μL洗滌液2，重復洗滌1次
磁力架吸盡殘液，室溫干燥5–10min（不干透）
加50μL洗脫液，65℃孵育5min，洗脫RNA
磁力架分離，取**上清（RNA）**至新管，冰上備用（或-80℃）
傳統(tǒng)TRIzol法見文末附錄。
五、RT-PCR反應體系配制（一步法，25μL體系）
在PCR潔凈區(qū)配制，冰上操作，避光。
1.體系配方（單管）
RT-PCR反應液：19.0μL
酶混合液：1.0μL
模板RNA（樣品/對照）：5.0μL
總體積：25.0μL
2.配液步驟（N+2管，含陰、陽性對照）
按樣品數(shù)計算總量：(N+2)×(19+1)μL，配成預混液
渦旋混勻，瞬時離心
每0.2mLPCR管分裝20μL預混液
分別加入5μL模板：
樣品管：5μL樣品RNA
陰性對照：5μL陰性對照RNA/DEPC水
陽性對照：5μLCSFV陽性對照RNA
蓋緊管蓋，瞬時離心（1000g，10s），放入PCR儀
六、擴增程序設置（GB/T16551-2020標準）
反轉錄：50℃，15min（1個循環(huán)）
預變性：95℃，10min（1個循環(huán)）
擴增（40個循環(huán)）：
95℃，15s（變性）
60℃，60s（退火+延伸，此步采集FAM熒光）
七、結果判定（嚴格按Ct值）
1.質控標準（必須滿足，否則試驗無效）
陰性對照：無擴增曲線，無Ct值
陽性對照：Ct≤32，擴增曲線正常S型
2.樣品判定
陽性：Ct≤38，且呈典型S型擴增曲線
可疑：38＜Ct＜40，需復檢（重新提取RNA+復測）
陰性：Ct≥40或無擴增曲線
八、關鍵注意事項（防污染+防假陰/假陽）
分區(qū)操作：樣品處理→配液→擴增，三區(qū)隔離，專用移液器
防RNase：全程無RNase耗材，戴手套、口罩，避免說話
防交叉污染：濾芯吸頭、離心管一次性使用；陽性對照最后加
RNA質量：組織樣品盡快處理，避免反復凍融；A260/A280=1.8–2.0
儀器校準：PCR儀定期校準溫度與熒光通道
附錄：TRIzol法RNA提取（傳統(tǒng)方法）
200μL樣品+800μLTRIzol，渦旋1min，室溫5min
加200μL氯仿，渦旋30s，室溫3min
4℃、12000g離心15min，取上層水相（約500μL）
加500μL預冷異丙醇，混勻，-20℃靜置30min
4℃、12000g離心15min，棄上清
加600μL75%乙醇洗滌，4℃、12000g離心10min，棄上清
重復洗滌1次，吸盡殘液，室溫干燥5min
加40μLDEPC水+2μLRNase抑制劑，溶解RNA，冰上備用
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